北陸先端科学技術大学院大学
マテリアルサイエンス

国立大学法人 北陸先端科学技術大学院大学 独立行政法人 環境再生保全機構

消化酵素で分解するナイロンを開発
―プラスチック誤飲事故の軽減、海洋生態系維持へ―

ポイント

• 海洋プラスチックごみは誤飲するなど海洋生物への悪影響がある
• 従来の生分解性プラスチックは性能が低い問題がある
• 植物由来分子であるイタコン酸とアミノ酸からナイロンの開発に成功
• 従来ナイロンよりも高性能かつ人工胃液で分解・崩壊する性質を発見

＜開発の背景と経緯＞

　植物などの生体に含まれる分子を用いて得られるバイオマスプラスチックは材料中に二酸化炭素を固定することにより、二酸化炭素濃度を削減し、低炭素社会構築に有効であるとされています。その中でも生分解性を有するものは、昨今深刻化する海洋プラスチックごみ問題の解決の糸口を与えるものと注目されています。特に、鳥類やクジラ類などの死骸の胃の中を調査するとプラスチックごみが蓄積している場合があり、それが原因で死に至った可能性が指摘されています。つまり、プラスチックごみの誤飲による生態系への被害が問題視されています。生分解性プラスチックの中には海洋環境で分解するものがあり、中には消化酵素で分解するものも開発されているため本問題を解決するためのキー材料となると考えられています。しかし、生分解性プラスチックのほとんどは柔軟なポリエステルで耐熱性や力学強度の点で問題があります。このため用途は限られ、主に使い捨て分野で使用されているのが現状です。たとえばPHBHと呼ばれる脂肪族ポリエステルは代表的な海洋分解性プラスチックを与えますが、その主骨格は一般的な工業用プラスチックに用いられる高分子に比べて柔軟であり、そのガラス転移温度は０℃付近であり室温での使用のためには高結晶化が余儀なくされます。また力学強度も20-30MPa付近です。（参考：ポリエチレン、塩ビ、ポリプロピレンなどの汎用プラスチックは20-70 MPa程度）
　研究チームは、麹菌などが糖を変換して生産するイタコン酸を用いてバイオナイロンを開発することを目的として研究を進めていますが、アミノ酸であるロイシンなどを導入した新たなモノマーを合成し、一般的なナイロンの原料の一つであるヘキサメチレンジアミンなどを反応させることでバイオナイロンを合成する条件を見出しました（図１）。得られたバイオナイロンはガラス転移温度が100℃を超え、力学強度が85MPaを超える高性能ナイロンであることも確認されました（表１）。この高性能発現はナイロン中に硬い構造であるヘテロ環が含まれることに由来します。
　最後に、L-ロイシンから得られるナイロン樹脂を合成し、これが胃中の消化酵素であるペプシンの存在下で崩壊（図２）し分子量も低下することが見いだされました（図３）。今後、海洋ごみの中でも被害の多い釣り糸や漁網などへの応用を目指し、さらには自動車エンジン周りなどで使用されているナイロンを代替する物質として設計する予定です。将来的には海洋ごみ問題解決への道しるべを提供するだけでなく、大気中二酸化炭素削減などへの波及効果も考えられます。

＜代表的作成方法＞
　ロイシン由来のジカルボン酸1-（（S）-1-カルボキシ-3-メチルブチル）-5-オキソピロリジン-3-カルボン酸とヘキサメチレンジアミン（1.3g、10mol）をそれぞれアセトニトリルに溶解させた後に溶液を混合することでナイロン塩を析出させました（収率96％）。白色のナイロン塩を真空乾燥後170-180℃、50-60 rpmで激しく攪拌しバルクで重合しました。6時間後、粘性のあるポリマー溶融物が形成されました。これをDMFに溶解しアセトンに再沈殿することで精製を行いました。

＜今回の成果＞
　今回の成果は大きく分けて２つ示すことができます。
１）鏡像関係にあるアミノ酸を分子鎖で混合したナイロンを合成することで、結晶化度および熱的力学的物性が向上することを発見
　一般に再生可能な原料から得られる高分子は、熱的力学的性能が低く製造コストも高くなります。したがって、化石ベースのリソースと比較してパフォーマンスを向上させることができる合成アプローチを開発し、バイオベースのモノマーを利用することが重要です。ここでは、再生可能なイタコン酸とアミノ酸（D-またはL-ロイシン）から派生した新規な光学活性ジカルボン酸の生産に成功しました。まず、イタコン酸由来のイタコン酸ジメチルを出発物質として、剛直な不斉中心を持つ複素環式ジカルボン酸モノマーを高純度で得ました。これらのモノマーからアモルファスでありホモキラリティーを有するD-またはL-ロイシン由来のポリアミドを合成し、かつこれらをモノマー段階で混合したもの、オリゴマー段階で混合し追重合を行ったものを対象として研究を進めました（図１）。その結果、D-ロイシン由来のポリマー鎖とL-ロイシン由来のポリマー鎖との複合体は結晶化し、その結晶化度は36％に達しました。これは、キラル相互作用に由来するものと考えられます。得られた樹脂は、ガラス転移温度Tgが約117°C、溶融温度Tmが約213°Cであり、ポリアミド11などの従来のポリアミド（Tg約57°C）よりも高い値を示しました。さらに2.2〜3.8 GPaの高いヤング率および86〜108 MPaの高い力学強度を示しました（表１）。

２）バイオナイロン樹脂がペプシンの作用により崩壊し分解することを発見
　バイオナイロンの酵素分解を、哺乳類の胃の消化酵素であるペプシンを使用して調べました。少量（150 mg）のポリアミド樹脂（Mw; 24,300-26,400 g / mol）と1 wt％のペプシン（5 ml）をpH 4.0のバッファーに入れて分解試験を行いました（対照実験はペプシンなし）。サンプルをインキュベーター内で37°Cで6週間振とうした結果、時間の経過に伴い平均分子量が24,300〜26,400 g / molから14,600〜16,500 g / molに減少することがわかりました（図３）。ペプシンによるナイロンの分解中の視覚的変化も崩壊現象として確認されました（図２）。研究チームは以前に、イタコン酸由来ポリアミドのピロリドンの開環反応を報告しましたが、今回発見した酵素分解はピロリドンの開環を誘発したと考えられます。ここで発見したペプシン分解は、哺乳類が当該ナイロン系プラスチックを誤飲した場合でも、哺乳類の消化管の安全性を維持することにつながる可能性があります。

＜今後の展開＞
　本成果によりイタコン酸由来バイオナイロンの構造的な広がりが提案できました。今後、海洋ごみの中でも被害の多い釣り糸や漁網などへの応用を目指し、さらには自動車エンジン周りなどで使用されているナイロンを代替する物質として設計する予定です。将来的には海洋ごみ問題解決への道しるべを提供するだけでなく、大気中二酸化炭素削減などへの波及効果も考えられます。

＜参考図＞　　　　　　　　　　　図１　（A）イタコン酸とアミノ酸からなるジカルボン酸モノマーの合成

　　　　　　　　　　　　　　（B）（A）のジカルボン酸とヘキサメチレンジアミンからのバイオナイロンの重合反応式

表１　バイオナイロンの物性表

図２　バイオナイロンがペプシン存在下で崩壊していく様子

図３　ペプシンを作用させたD-ロイシン由来バイオナイロンのGPC

【論文情報】

令和3年5月10日

次世代燃料電池のアニオン交換薄膜において
水酸化物イオン伝導度の評価法を確立

ポイント

• 高分子薄膜状のアニオン交換膜の水酸化物イオン伝導度と含有水分子量の評価法を確立
• サンプルの合成から評価まで、空気中の二酸化炭素の影響を排除
• 0.05 S cm^-1の高い水酸化物イオン伝導性（Br^-型のアニオン交換薄膜の２倍以上）
• 次世代燃料電池の性能向上への貢献が期待

【研究背景と内容】

　資源の少ない日本が脱炭素化を進めながら持続的な発展をするためには、多様なエネルギー資源を確保することが喫緊の課題です。長尾准教授らは、これまで水素社会に貢献する燃料電池の性能向上に関する研究を推進してきました。
　長尾准教授らは、現在の燃料電池に利用されるプロトン交換膜に加え、次世代燃料電池で利用が検討されているアニオン交換膜における、水酸化物イオン伝導性の研究に取り組んでいます。この次世代燃料電池は、従来必要とされてきた白金などの貴金属触媒に依存せずに動作が可能であることから、世界的に研究報告例が増加しています。アニオン交換膜とは、陰イオンが膜の内部を移動可能な材料であり、特に水酸化物イオンが高速に移動する材料はこの燃料電池に欠かせません。水酸化物イオンが内部を移動するアニオン交換膜は、空気中の二酸化炭素と容易に反応する特徴があり、燃料電池の性能を低下させることが知られています。アニオン交換膜の水酸化物イオン伝導性を評価するためには、膜を水に浸漬することで空気中の二酸化炭素の影響を排除する必要がありました。しかし、実際の燃料電池では、アニオン交換膜は水に浸った状態で動作していないため、二酸化炭素の影響を排除した、より燃料電池の動作環境に近い加湿状態での評価法が求められてきました。

　アニオン交換膜のもう一つの重要な役割は、燃料電池の反応場である電極触媒界面に薄膜状で存在することにより、アニオン交換膜から電極触媒へ水酸化物イオンを高速に輸送することです。しかし、これまでは水酸化物イオン型のアニオン交換薄膜の水酸化物イオン伝導性と含有水分子量を評価する方法がありませんでした。今回、長尾准教授らは、モデル高分子として合成したアニオン交換膜を基板上に薄膜化し、薄膜の作成から各種物性評価の終了までの間、空気中の二酸化炭素の影響を受けない評価方法を確立し、世界で初めてアニオン交換薄膜における水酸化物イオン伝導性と含有水分子量を明らかにしました。

　研究成果として、水酸化物イオン型のアニオン交換薄膜(OH^-型、図１)は、0.05 S cm^-1と比較的高い水酸化物イオン伝導性を示すことや、臭化物イオン型のアニオン交換薄膜(Br^-型)と比較すると約２倍のイオン伝導度を有することがわかりました（図２）。さらに、厚膜状のアニオン交換膜と270nmの厚さの薄膜では、水酸化物イオン伝導度が同程度であることも明らかにしました。この結果はプロトン交換膜で知られている、厚さが薄くなるにつれてイオン伝導度が低下する傾向と異なる知見となりました。

図１　アニオン交換膜(Poly[9,9-bis(6'-(N,N,N-trimethylammonium)-‌hexyl)-9H-‌fluorene)-‌alt-‌(1,4-benzene)] (PFB⁺), X = OH and Br）

図2　アニオン交換薄膜におけるイオン伝導度の比較

【今後の展開】
　空気中の二酸化炭素の影響を受けない状態で、アニオン交換薄膜の水酸化物イオン伝導度と含有水分子量の相関に関する知見を得た例は世界初となります。これらの研究成果は、次世代燃料電池の反応場を設計する上で重要な知見となりえます。今後長尾准教授らは、確立した評価手法を利用して、分子構造の異なる複数のアニオン交換膜の評価を推進することで、得られた知見が普遍性を有するのかどうかを含め検討していく予定です。

【研究資金】
・日本学術振興会（JSPS）科研費 基盤研究（C）(JP18K05257)
・日本学術振興会（JSPS）科研費 基盤研究（B）(JP21H01997)
・日本学術振興会（JSPS）科研費 新学術領域研究「ハイドロジェノミクス」(JP21H00020）

【論文情報】

令和3年5月7日

国立大学法人 北陸先端科学技術大学院大学 国立大学法人 金沢大学

世界初！ 個々の原子間の結合強度の測定に成功
―強くて伸びる白金原子の鎖状物質―　

ポイント

• 個々の原子の並びを見ながら、その結合強度を測る手法（顕微メカニクス計測法）の開発
• 白金原子が一列に並んだ鎖状物質を作製し、その結合強度を測定
• 結合強度が高く、よく伸びる白金原子の鎖状物質
• 原子スケールで制御された機能性物質探索への期待

　原子が鎖状に並んだ1次元物質の力学的性質は、同じ組成や構造を持つバルク物質と大きく異なることが理論計算によって予想されていた。しかし、1次元物質の性質はわずかな原子の変位にも敏感に変化するため測定例が少なく、解明が進んでいない。原子配列構造とその力学的性質の相関を明らかにできれば、1次元物質などの性質を決めるメカニズムの解明に繋がる。このメカニズムこそが、1次元物質を活用した新しい原理で動作する電子デバイスやセンサー開発の指針となる。

　最近、私たちは、原子配列を直接観察できる透過型電子顕微鏡（TEM）のホルダーに細長い水晶振動子を組み込んで、原子スケール物質の原子配列とその機械的強度の関係を明らかにする顕微メカニクス計測法を世界で初めて開発した（図1）。この手法では、水晶振動子の共振周波数が、物質との接触で相互作用を感じることによって変化することを利用する。共振周波数の変化量は物質の等価バネ定数に対応するので、その変化量を精密計測すればナノスケール/原子スケールの物質の力学特性を精緻に解析できる。水晶振動子の振動振幅は27 pm（水素原子半径の約半分）で、TEMによる原子像がぼやけることはない。この手法は、従来の手法（小さなSi製テコを利用してその変位から力を計測する手法、TEM-AFM法^[*1]）では困難だった結合強度の高精度測定を実現している。

　本研究では、このTEMホルダー内部で白金原子鎖を150個作製してその特性を詳細に調べ、白金原子鎖における原子結合強度が25 N/mであることを突きとめた。この値は、白金のバルク結晶の原子結合強度20 N/mよりも25％高い。また、原子間結合の長さ（0.25 nm）は最大0.06 nmも延びることが分かった。これは原子結合の最大弾性ひずみが24％になることを示しており、バルク結晶の値（5％以下）と比較して著しく高い（図２）。さらに、第一原理計算の結果を合わせて考察することで、このような特異な原子結合の性質は、白金原子鎖がエネルギー的に最安定な構造ではなく、形成に必要な張力が極小となる構造を取ることによって生まれることがわかった。

　本研究は、1次元物質がもつ特異な原子結合に関わる性質を明らかにし、理論計算と組み合わせることによって形成メカニズムを突きとめた点に大きな成果がある。今後ますます期待される原子スケールで制御された機能性物質の創製に指針を与える大きな成果である。

図１．個々の原子の並びを観察しながら、原子間の結合強度を計測する顕微メカニクス計測法。透過型電子顕微鏡（TEM）を用いてナノ物質の構造観察をしながら、長辺振動水晶振動子（LER）を用いて物質の結合強度を計測できる。この測定によって、赤矢印で示す部位の白金原子鎖の原子間結合強度が25 N/mであることがわかった。

図2. 左上は透過型電子顕微鏡（TEM）像、左下はそのシミュレーション像である。原子4個からなる原子鎖が得られている。その観察時に測定された電気伝導（コンダクタンス量子単位G₀でプロット）とばね定数の時間変化を、それぞれ右上と右下に示す。赤い矢印で示す領域は形成した原子鎖を破断することなく引っ張ることができた時間帯である。毎秒0.08 nmの速度で引っ張っており、白金原子鎖は破断なく約0.1 nm伸びた。

【論文情報】

【用語解説】
[*1] TEM-AFM法（透過型電子顕微鏡と原子間力顕微鏡を組み合わせた測定法）
　従来の測定法の一つ。ナノ物質に接触したSiカンチレバーを引っ張ると、Siカンチレバーがたわむ（変位する）。このたわみ（変位）から、ナノ物質に負荷されている力を求める。一方、この負荷された力によって変形したナノ物質を透過型電子顕微鏡によって計測することで、このナノ物質の機械的強度を得る。ただし、10 nm以下のサイズをもつナノ物質は1Åしか変形しない（原子間距離は2-3Åである）。このような変形を高い精度で測定することは難しく、ナノ物質の強度測定にばらつきが出てしまうという課題があった。

令和3年4月30日

国立大学法人 北陸先端科学技術大学院大学 国立大学法人東海国立大学機構　岐阜大学 国立大学法人 大阪大学

生体分子モーターで動く人工筋肉、光で自在に作製可能
― マイクロ・ソフトロボットの３Ｄプリントの実現に期待 ―

ポイント

• 光照射した場所に自在な形状に作製できる人工筋肉の開発に成功
• 遺伝子工学的に改変した生体分子モーターからなる光応答性の分子システムを開発
• ミリメートルスケールの微小機械の駆動を実証
• マイクロロボットやソフトロボットの３Ｄプリントの実現に期待

【研究背景と内容】

　生物のエンジン「筋肉」は、モータータンパク質^[*1]と呼ばれる生体分子モーターから構築されており、数百マイクロメートル（マイクロは100万分の1）から数十メートルまでスケーラビリティにとんだアクチュエータである。生物のエネルギー源（アデノシン三リン酸 (ATP)）を用いて高い効率で力学的仕事を行うという、従来のアクチュエータと比べ質的に異なる特性を持ち、これまでには無い産業分野での応用が期待されている。しかし、筋肉自体または筋肉細胞をアクチュエータとして利用する試みは基礎研究レベルでは報告されているが、筋肉細胞の安定性・保存性の問題やアクチュエータとして組み込む技術が未発達のため、実用化には至っていない。また、筋肉組織の構成分子はほぼ同定されているが、それら構成分子から筋肉を再構築する技術は知られていなかった。

　本研究では、生体内の収縮性ファイバーの形成過程に着想を得て、人工筋肉を自在に形成させる分子システムを開発した。モータータンパク質の一種であるキネシンを遺伝子工学的に改変し、フィラメント状にすることにより、レールタンパク質である微小管^[*2]と混ぜるだけで、モータータンパク質の動的な機能により自己組織的に人工筋肉を形成させることができた。さらに、光照射によりモーター分子のフィラメント化を開始させ、照射した部位のみに人工筋肉を形成させることを可能とした（図１）。この人工筋肉を大きさ数ミリメートルの機械構造内に形成させることにより微小機械を駆動させることに成功した（図２）。

　筋肉のような柔軟で低エネルギー・低環境負荷なアクチュエータの産業応用は期待されているが、上述のように実用化には至っていない。本研究では、生体の運動素子であるモータータンパク質分子を数ミリメートル以上の組織に構築することにより、生物の筋肉に似た機能・性質を持つ人工筋肉の製造を可能とした。特に光照射により人工筋肉の形成を開始可能なことから、たとえば光造形型の３Ｄプリンタに組み込めば人工筋肉の光造形などが可能になることが将来期待でき、生体材料で駆動するマイクロロボットやソフトロボットの３Ｄプリント技術の基盤技術となる可能性が高い。

【今後の展開】

　本研究で開発された人工筋肉は、現時点では形成・収縮が同時に起こり、かつ収縮は一回のみで用途も限定される。今後、制御用の分子システムを開発することにより、可逆または振動可能な人工筋肉を開発しマイクロロボットやソフトロボットへの実装を目指す。

図１．光照射による人工筋肉形成のコンセプト図
　モータータンパク質の一種キネシンを遺伝子工学的に改変し、光照射によりキネシンがフィラメント状になるように設計（K456m13とCaMLMM）。キネシンフィラメントは自身の運動能により微小管を引っ張り、自己組織的に筋肉に似た収縮性の繊維を形成する。

図2. 人工筋肉の応用例
　大きさ数ミリメートルのシリコンゴム製の微小構造の周囲に、光照射により人工筋肉を形成させ、その構造を駆動させた。右上）マイクログリッパ：光照射後に人工筋肉（オレンジ色）が形成し、20秒後にグリッパが閉じる。右下）昆虫型デバイス：人工筋肉により左右に動く。左上）ロボットアーム型デバイス。左中）微小歯車の組み立て。左下）細胞サイズの微小ビーズの集積。

【研究資金】

　・新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）「次世代人工知能・ロボット中核技術開発」（JPNP15009）
　・日本学術振興会（JSPS）科研費 新学術領域研究「分子ロボティクス」(JP24104004）
　・日本学術振興会（JSPS）科研費 基盤研究（B）(JP18H01407)

【論文情報】

【用語解説】
[*1] モータータンパク質（motor protein）
　生体の動きに関与するタンパク質の総称。大きさ数ナノメートル〜数十ナノメートルの分子で、代表的なものとして筋収縮に働くミオシン、細胞内の物質輸送に働くキネシン、鞭毛運動等に働くダイニンなどが挙げられる。これらは繊維状のタンパク質であるアクチンまたは微小管の上を生体のエネルギーであるATP(アデノシン三リン酸)の加水分解エネルギーを利用して一方向に動く。

[*2] 微小管（microtubule）
　細胞骨格を構成する繊維状タンパク質のひとつ。大きさ数ナノメートルのチューブリンが筒状に重合することにより直径25ナノメートルの管状の繊維を形成する。キネシンやダイニンなどモータータンパク質が動くレールとして働く。

令和3年4月20日

先端科学技術研究科の桶葭准教授が文部科学大臣表彰 若手科学者賞受賞

　北陸先端科学技術大学院大学（学長・寺野稔、石川県能美市）先端科学技術研究科 環境・エネルギー領域の桶葭 興資（おけよし　こうすけ）准教授が、令和３年度科学技術分野の文部科学大臣表彰 若手科学者賞を受賞することが決定し、文部科学省から4月6日に発表されました。

　＊文部科学省の発表はこちら

　文部科学大臣表彰とは、科学技術に関する研究開発、理解増進等において顕著な成果を収めた者について、その功績を讃え贈られるものです。
　今回の受賞は、桶葭准教授の下記の業績が評価されたことによります。

若手科学者賞
■受賞者　先端科学技術研究科　准教授　桶葭 興資

■業績名 「水と共生する生体模倣高分子材料に関する研究」

【主要論文】
・「Polymeric design for electron transfer in photoinduced hydrogen generation through coil-globule transition.」Angewandte Chemie International Edition 58, 7304 (2019).
・「Emergence of polysaccharide membrane walls through macro-space partitioning via interfacial instability.」Scientific Reports 7, 5615 (2017).

令和3年4月6日

国立大学法人筑波大学 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 国立研究開発法人科学技術振興機構（ＪＳＴ）

ダイヤモンドを用いた広帯域波長変換に成功
～新しい量子センシング技術の糸口に～

【研究代表者】

筑波大学 数理物質系
　長谷 宗明教授
北陸先端科学技術大学院大学 先端科学技術研究科 応用物理学領域
　安 東秀准教授

【研究の背景】

　天然のダイヤモンド単結晶は、地球のマントルにおいて超高温かつ超高圧下で生成されます。高純度のダイヤモンド単結晶は希少で高価なため、産業応用は限られていました。しかし、20世紀中頃から、不純物濃度が極めて低い高純度ダイヤモンド単結晶が人工的に安価に作製できるようになり、エレクトロニクスや光学分野で応用されるようになりました。
　高純度ダイヤモンド単結晶は結晶学的に対称性が高く、空間反転対称性を持つ（対称点を中心に結晶を反転させると結晶構造が重なる）ため、非線形光学の観点では2次の非線形感受率^注1）がゼロとなり、2次の非線形光学効果が発現しません。そのため、光学分野でのダイヤモンドの研究開発は、光カー効果^注2）や2光子吸収^注3）など、もっぱら3次の非線形光学効果を基に光共振器や光導波路に関する研究が行われてきました。応用上でも重要である2次の非線形光学効果の研究はほとんど行われて来なかったのです。しかし、最近の研究で、高純度ダイヤモンド単結晶に窒素−空孔（Nitrogen-Vacancy: NV）センター^注4）と呼ばれる格子欠陥を導入することにより、欠陥準位を介したマイクロ波による発光制御が可能になり、この原理を用いた量子センシング^注5）の研究が活発になっています。
　今回、本研究チームは、高純度ダイヤモンド単結晶の表面近傍にNVセンターを導入してダイヤモンド単結晶の対称性を操作し、第二高調波^注6）および第三高調波の発生について研究しました。

【研究内容と成果】

　本研究チームは、フェムト秒（1000兆分の1秒）の時間だけ赤外域の波長で瞬く超短パルスレーザー^注7）を、NVセンターを導入した高純度ダイヤモンド単結晶に照射し、表面近傍から発生した第三高調波に加えて、第二高調波を世界で初めて観察することに成功しました。
　具体的には、波長1350nmの赤外パルスレーザー光を励起光として照射すると、第二高調波が1／2波長の約675nmに、また第三高調波が1／3波長の約450nmに発生することが明らかになりました（参考図1）。この時、レーザーを照射されたダイヤモンド単結晶は紫色（赤色と青色の混成色）に発光していることが分かります（参考図1挿入写真）。
　従来のダイヤモンド中NVセンターの研究では、連続発振グリーンレーザー（波長532nm）を照射した際に、NVセンターの欠陥準位を介した発光が、約660nmを中心とした波長領域に現れることが分かっています。このような既知の発光である可能性を取り除き、今回観測された約675nmの発光が第二高調波発生であることを確かめるため、励起レーザーの波長を掃引して波長変換特性を調べました。その結果、励起レーザーの波長の変化に応じて、第二高調波だけでなく第三高調波の発光波長が逐次変化することが確かめられました（参考図2）。これにより、今回観測された発光は、常に660nmを中心とした波長領域に観測される従来の欠陥準位を介した発光ではなく、欠陥により結晶の対称性が崩れることによる2次の非線形光学効果、すなわち第二高調波発生であることが明らかになりました。さらに、その変換効率は短波長ほど大きくなり、最高で5x10^-5に達することが分かりました。今回、第二高調波がダイヤモンドの表面近傍約35nmの非常に薄い領域から発生していることを鑑みても、極めて高い変換効率であることが分かります。
　また、励起レーザーの偏光角を回転させることで、第二高調波と第三高調波の発光強度の変化を調べたところ、それらの偏光角依存性はNVセンターを導入する前の高純度ダイヤモンドのパターンとは明らかに異なることが分かりました（参考図3）。特に、NVセンターを導入したダイヤモンドでは、第二高調波と第三高調波のパターンが若干の回転を除けば非常に似ていることが分かり（参考図3bとc）、これらのことから、第三高調波は第二高調波が駆動力になっていることも示唆されました。

【今後の展開】

　本研究チームは、2次の非線形光学効果である第二高調波発生や電気−光学効果を用いた量子センシング技術を深化させ、最終的にダイヤモンドを用いたナノメートルかつ超高速時間領域（時空間極限領域）での量子センシングの研究を進めています。今後は、フェムト秒パルスレーザー技術が持つ高い時間分解能と、走査型プローブ顕微鏡^注8）が持つ高い空間分解能とを組み合わせ、ダイヤモンドのNVセンターから引き出した2次の非線形光学効果が、電場や温度のセンシングに応用できることを示していきます。さらに、今回の成果は、ダイヤモンドNVセンターにより、2次の非線形光学効果のみならず、4次、6次以上の高次の非線形光学効果の開発に貢献することが期待されます。

【参考図】

図1．本研究に用いた実験手法と結果
　NVセンターを導入したダイヤモンドに波長1350nmの励起光を照射し、その発光スペクトルを分光器で測定すると、波長約675nmに第二高調波(SHG)が、また約450nmに第三高調波(THG)が発生することが分かった。これは、エネルギーω（波長にすると1350nm）の2光子からエネルギー2ω（波長にすると675nm）の第二高調波がNVセンターによる結晶の対称性の崩れから発生していることに相当する(挿入図)。

図2．変換効率の発光波長依存性
　第二高調波(SHG)と第三高調波(THG)の変換効率を励起レーザーの波長を変化させて記録した。

図3．発光強度の励起光偏光角依存性とエネルギーダイヤグラム
　高純度ダイヤモンド（Pure diamond）(a)およびNVセンターを導入したダイヤモンド（NV diamond）において、第二高調波(SHG) (b)と第三高調波(THG) (c)の発光強度の励起光偏光角依存性をプロットしたもの。(d) 第二高調波発生から第三高調波発生へ向かうエネルギーダイヤグラムを示す。

【用語解説】
注1） 非線形感受率
　物質の光への応答は、パルスレーザー光のように光電場振幅が大きくなると振幅に比例せず、非線形な非線形光学効果となる。非線形感受率は非線形光学効果の大きさを特徴づける光学定数である。
注2） 光カー効果
　媒質中に光が入射した際に、媒質の屈折率が光強度に比例して変化する現象で、1875年にJohn Kerrによって発見された3次の非線形光学効果（電場振幅の三乗に比例する効果）の一種である。
注3） ２光子吸収
　二つの光子が同時に媒質に吸収される現象で、3次の非線形光学効果の一種である。
注4） 窒素−空孔（NV）センター
　ダイヤモンドは炭素原子から構成される結晶だが、結晶中に不純物として窒素（Nitrogen）が存在すると、すぐ隣に炭素原子の抜け穴（空孔：Vacancy)ができることがある。この窒素と空孔が対になった「NV（Nitrogen-Vacancy）センター」は、ダイヤモンドの着色にも寄与する色中心と呼ばれる格子欠陥となる。NVセンターには、周辺環境の温度や磁場の変化を極めて敏感に検知して量子状態が変わる特性があり、この特性をセンサー機能として利用することができる。このため、NVセンターを持つダイヤモンドは「量子センサー」と呼ばれ、次世代の超高感度センサーとして注目されている。
注5） 量子センシング
　量子化した準位や量子もつれなどの量子効果を利用して、磁場、電場、温度などの物理量を超高感度で計測する手法のこと。
注6） 第二高調波
　二つの同じ周波数（波長）を持つ光子が非線形光学結晶に入射すると、入射した光子の2倍の周波数（半分の波長）の光を発生する現象のこと。2次の非線形光学効果（電場振幅の二乗に比例する効果）の一種である。
注7） 超短パルスレーザー
　パルスレーザーの中でも特にパルス幅（時間幅）がフェムト秒以下の極めて短いレーザーのこと。光電場の振幅が極めて大きいため、2次や3次の非線形光学効果を引き起こすことができる。
注8） 走査型プローブ顕微鏡
　小さいプローブ（探針）を試料表面に近接させ、探針を表面に沿って動かす（走査する）ことで、試料の原子レベルの表面構造のみならず、温度や磁性などの物理量も画像化できる顕微鏡である。

【研究資金】

　本研究は、国立研究開発法人 科学技術振興機構 戦略的創造研究推進事業CREST「ダイヤモンドを用いた時空間極限量子センシング」（研究代表者：長谷 宗明）による支援を受けて実施されました。

【掲載論文】

令和3年3月18日

リチウムイオン２次電池の長期的耐久性の課題解決に資する
超高耐久性バインダーを開発

ポイント

• リチウムイオン２次電池の長期的耐久性の課題の解決に資する超高耐久性負極バインダーの開発に成功した。
• 1700回の充放電サイクルを経ても95%の容量維持率を示した。
• 本バインダー材料を用いた系ではPVDF系で顕著であった電解液の電気分解が抑制された。
• 充放電サイクル後に、本バインダー材料を用いた電池系ではPVDF系と比較して大幅に低い（45%減少）内部抵抗が観測された。
• 各種電気化学測定により、負極内部のリチウムイオンの拡散性に優れていることが分かった。本バインダー系ではイオンの拡散係数がPVDF系を15%上回った。
• ヤング率、引張強度のいずれにおいても本バインダーはPVDFと比較して大幅に優れた力学的強靭さを示した。
• 電極―電解質界面抵抗を低減できる高耐久性バインダーとして、リチウムイオン２次電池のみならず広範な蓄電デバイスへの応用が期待される。

　本成果は「ACS Applied Energy Materials」(米国化学会)オンライン版に2月17日に掲載された。

【今後の展開】

　セル構成や充放電条件を最適化し、最も優れた特性を有する蓄電デバイスの創出に結びつける。
　更に異なる材料組成から成る高容量負極材料への適用を進めつつある。
　電極―電解質界面抵抗を大幅に低減できる機能性高分子バインダーとして、リチウムイオン２次電池のみならず広範な蓄電デバイスへの応用が見込まれる。

【用語解説】
^*1 リチウムイオン２次電池：
電解質中のリチウムイオンが電気伝導を担う２次電池。従来型のニッケル水素型２次電池と比較して高電圧、高密度であり、各種ポータブルデバイスや環境対応自動車に適用されている。
^*2 LUMO：
電子が占有していない分子軌道の中でエネルギー準位が最も低い軌道を最低空軌道(LUMO; Lowest Unoccupied Molecular Orbital)と呼ぶ。
^*3 HOMO：
電子が占有している分子軌道の中でエネルギー準位が最も高い軌道を最高被占軌道(HOMO; Highest Occupied Molecular Orbital)と呼ぶ。
^*4 サイクリックボルタンメトリー（サイクリックボルタモグラム）：
電極電位を直線的に掃引し、系内における酸化・還元による応答電流を測定する手法である。電気化学分野における汎用的な測定手法である。また、測定により得られるプロファイルをサイクリックボルタモグラムと呼ぶ。
^*5 電極―電解質界面抵抗：
エネルギーデバイスにおいては一般的に個々の電極の特性や個々の電解質の特性に加えて電極―電解質界面の電荷移動抵抗がデバイスのパフォーマンスにとって重要である。交流インピーダンス測定を行うことによって個々の材料自身の特性、電極―電解質界面の特性等を分離した成分としてそれぞれ観測し、解析することが可能である。

令和3年3月1日

がん光細菌療法の新生

ポイント

• 高い腫瘍標的能を有し、近赤外光によって様々な機能を発現する光合成細菌の発見
• 当該細菌を活用したがん診断・治療技術の創出

図1. がん光細菌療法の概念。NIR: 近赤外、FL: 蛍光、ROS: 活性酸素種、PA: 光音響。

【論文情報】

【関連研究情報】

北陸先端科学技術大学院大学（JAIST）、先端科学技術研究科物質化学領域の都研究室では、近赤外レーザー光により容易に発熱するナノ材料の特性（光発熱特性）に注目し、これまでに、"三種の神器"を備えた多機能性グラフェン（2020年4月23日 JAISTからプレス発表）、ナノテクノロジーと遺伝子工学のマリアージュ（2020年8月17日 JAISTからプレス発表）などの光がん療法を開発している。

【用語解説】

*1　近赤外レーザー光
レーザーとは、光を増幅して放射するレーザー装置、またはその光のことである。レーザー光は指向性や収束性に優れており、発生する光の波長を一定に保つことができる。とくに700～1100 nmの近赤外領域の波長の光は生体透過性が高いことが知られている。
*2　紅色光合成細菌
近赤外光を利用して光合成を行う細菌。水の分解による酸素発生は行わない。

令和3年2月16日

北陸先端科学技術大学院大学 理化学研究所

高分子化合物による細胞の凍結保護効果の機序を解明
－再生組織などの長期保存技術の開発に貢献－

ポイント

• 高分子化合物による細胞の凍結保護効果の機序の一端を解明。
• 細胞凍結保護効果を説明するため初めて固体NMRの手法を応用し、細胞の脱水制御に伴う細胞内氷晶抑制効果を説明した。
• この手法を利用することで、新しい効果的な凍結保護物質の分子設計が可能となり、再生医療分野などへの応用が期待できる。

【研究の背景】

　医学生物学研究に必要な細胞は、細胞バンクなどから凍結状態で入手できる。細胞の凍結保存技術自体は1950年代に確立されており、おもにジメチルスルホキシド(DMSO)[＊注1]が保護物質として細胞懸濁液に添加され、液体窒素温度にて凍結保存されている。一般的な樹立細胞などは既存の保存技術で問題なく保存可能な細胞が多いが、受精卵などの生殖細胞、ES細胞やiPS細胞[＊注2]などの特殊な幹細胞などの中には凍結保存が困難なものが多く、効率的な保存技術の開発が望まれている。また、汎用保護剤であるDMSOは毒性があり、分化[＊注3]への影響もあることから再生医療分野では代替の物質の開発が望まれているが、この半世紀ほどは新しい凍結保護物質の報告はほとんど見られなかった。高分子系の保護物質は細胞膜を容易には透過しないため、細胞への毒性や分化への影響を低くすることが可能である一方、細胞外から凍結保護を行うということから開発は困難とされてきた。2009年に松村らが両性電解質高分子[＊注4]による凍結保護作用を発表し[1]、その後、多くの細胞種で凍結保護効果が確認されてきた。また、急速に凍結することで細胞内外の水の結晶化を抑制するガラス化保存技術[＊注5]にも両性電解質高分子が利用され、受精卵や胚[2]や軟骨細胞シート[3]、スフェロイド[＊注6] [4]などの保存に成功した。また、高分子化合物による凍結保護物質の報告は世界中で近年になって非常に多く行われており、多くの分野での応用が期待されている。しかしながら、その具体的なメカニズムはわかっていない。

【研究成果と手法】

　これまでDMSOなどの低分子による細胞膜透過性の凍結保護物質については、細胞内の水の結晶化を抑制することが主な機序として報告されてきている。しかし、高分子凍結保護剤の細胞外からの保護作用の機序は詳細にはわかっておらず、最近の論文では細胞外の氷の結晶（氷晶）の成長抑制作用と説明されている。確かに氷晶は物理的に細胞を破壊するため、その抑制が重要であることは間違いがないが、一方で、細胞内に大きな氷晶が形成されることは、細胞内小器官の破壊を伴う致命的なダメージを与えるとされているため、細胞内氷晶の形成が抑制されていることが考えられる。細胞内氷晶の形成については、一般的には顕微鏡などで観察されるが、凍結時の細胞内の現象を正確に捉えることが難しいため、はっきりしたことは分からない状況であった。
　研究グループらは、両性電解質高分子溶液の凍結保護の分子メカニズムを調べるため、固体NMR[＊注7]の手法を初めて応用し、凍結保護という複雑かつ多面的な現象の特徴を塩や水、高分子の運動と状態からの視点で解き明かすことに成功した。
　両性電解質高分子であるカルボキシル基導入ポリリジン(PLL-(0.65)　(図1))溶液、比較対象として、凍結保護効果の高いDMSO溶液、凍結保護効果のあまり見られないアルブミン（BSA）溶液、ポリエチレングリコール(PEG)溶液、保護効果のない生理的食塩水について、0℃から-41℃までの水分子および塩（イオン）の運動性を固体NMR測定により評価した。その結果、低温時の水の運動性がPLL-(0.65)溶液において他の溶液に比べ顕著に抑制され粘性が上昇することがわかった(図2)。凍結条件下では、この粘性の高いポリマー溶液が細胞の周辺を取り囲むことにより、細胞内への氷晶の侵入による細胞内氷晶形成を抑制していることが示唆される。また、PLL-(0.65)溶液中では高分子鎖にNaイオンがトラップされ、低温域でのNaイオンの運動性が低下していることも確認された(図3)。これにより、浸透圧に寄与するNaイオンの濃度がPLL(0.65)溶液において低下し、急激な脱水を抑制し、温和な条件でかつ十分に細胞内を脱水できる最適条件を達成していることが細胞内氷晶の形成の抑制を示唆する結果となった。これらの機序を図4に模式図として表す。低温時に高分子が塩や水を包含した会合体を形成し、それらの運動性が低下することで温和な条件でかつ十分に脱水が起こると共に、細胞外溶液の粘性の上昇に伴う細胞外氷晶の成長も抑えられ、結果的に細胞内氷晶の形成が抑制されることが細胞の凍結保護を可能としていることが考えられる。この機序は細胞内に浸透する既存の凍結保護剤と異なることから、新たな機序に基づく凍結保護剤の開発につながる研究成果である。

【今後の展開】

　固体NMR測定により高分子や塩、水の分子運動の観点から細胞凍結保護高分子の新規機序について考察することが可能となった。この手法により効果の高い凍結保護剤の設計指針が得られることが期待される。また、細胞だけでなく、再生組織などの2次元3次元の生体組織などの効率的な保存法、保存剤の開発に役立つことが期待できる。

図1　本研究で使用した両性電解質高分子であるカルボキシル化ポリリジンの構造。PLL-(0.65)は、コハク酸付加部位(m)が65%であるものを示す。

図2　1H NMRの水のピーク幅の温度依存性。PLL-(0.65)に顕著な広幅化が見られ、低温での粘性の急上昇が確認された。

図3　a) 23Na NMRのピーク面積から、各溶液中の凍結下、氷と共存する溶液状態にあるNaイオンの量を評価した。凍結下のPLL-(0.65)溶液において、溶液として振舞うNaイオンの量が低下した。b)Naイオン量から系中のNaCl濃度を計算した結果。PLL-(0.65)溶液中のNaCl濃度は温度低下と共に速やかに上昇し、低温下で緩やかに下降する。これは速やかかつ適度な細胞の脱水による細胞内氷晶形成の抑制を示唆している。

図4　PLL-(0.65)溶液による細胞の凍結保護効果の模式図。低温凍結下、1) 高分子が高い粘性を持つ会合体（マトリックス）を形成することで、細胞外からの氷核の流入を阻止し、2) 塩や水をマトリクス内にトラップすることにより、凍結後の脱水を温和な条件で制御するという2つの効果で細胞内の氷晶形成を抑制している。また、マトリックス形成による粘度上昇は、氷晶が細胞膜を刺激する事による細胞内氷晶形成も抑制していることが示唆された。

【参考文献】

[1] Matsumura K, Hyon SH, Polyampholytes as low toxic efficient cryoprotective agents with antifreeze protein properties. Biomaterials 30, 4842-4849 (2009)
[2] Kawasaki Y, Kohaya N, Shibao Y, Suyama A, Kageyama A, Fujiwara K, Kamoshita M, Matsumura K, Hyon S-H, Ito J, Kashiwazaki N. Carboxylated ε-poly-L-lysine, a cryoprotective agent, is an effective partner of ethylene glycol for the vitrification of embryos at various preimplantation stages. Cryobiology, 97, 245-249 (2020)
[3] Hayashi A, Maehara M, Uchikura A, Matsunari H, MatsumuraK, Hyon SH, Sato M, Nagashima H. Development of an efficient vitrification method for chondrocyte sheets for clinical application. Regenerative Therapy, 14, 215-221 (2020)
[4] Matsumura K, Hatakeyama S, Naka T, Ueda H, Rajan R, Tanaka D, Hyon SH. Molecular design of polyampholytes for vitrification-induced preservation of three-dimensional cell constructs without using liquid nitrogen. Biomacromolecules, 21, 3017-3025 (2020)

【用語解説】

注1　ジメチルスルホキシド(DMSO)
　分子式C₂H₆SOの有機溶媒の一種。実験室レベルから工業的規模に至るまで広く溶媒として使用される他、10％程度の溶液は細胞の凍結保存として使用されている。
注2　ES細胞やiPS細胞
　多能性幹細胞の一種。ES細胞は胚性幹細胞、iPS細胞は人工多能性幹細胞の略である。生体外にて、理論上ほぼすべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させることができるため、有力な万能細胞の一つとして再生医療への応用が期待されている。現在はDMSOを使用した保存液で保存されているが、DMSOの分化への影響が危惧される。
注3　分化
　多細胞生物において、個々の細胞が構造機能的に変化すること。
注4　両性電解質高分子
　一分子中にプラスとマイナスの電荷を共にもつ高分子化合物。
注5　ガラス化保存技術
　受精卵などの保存によく用いられている超低温保存の一つ。凍結時においても氷の結晶を形成しにくい溶質濃度の高いガラス化液を用い、保存した細胞が氷による物理的傷害を受けにくい。
注6　スフェロイド
　三次元的な細胞のコロニーで、再生医療の組織形成のビルディングブロックとして期待されている。
注7　固体NMR
　固体NMRとは固体試料を観測対象とした核磁気共鳴 (NMR) 分光法で、方向依存的な異方性相互作用の存在のため共鳴線の線幅が広いのが特徴である。通常、共鳴線の先鋭化のため、試料を静磁場に対してマジック角（54.7°）傾けて、超高速で回転（MAS：Magic Angle Spinning）させて測定を行う。本研究では、温度制御装置を備え付けた固体MAS検出器により、プロトンとナトリウムの核磁気共鳴スペクトルを測定し、低温時の水やNaイオン、高分子の運動性について議論した。

【論文情報】

令和3年2月9日

北陸先端科学技術大学院大学 北海道大学 科学技術振興機構

ハイスループット実験と触媒インフォマティクスが実現する
ゼロからの触媒設計

ポイント

• 物質空間からの無作為なサンプリング
• ハイスループット実験による触媒ビッグデータの取得
• バイアスを含まないデータからの触媒設計指針の抽出

【論文情報】

【用語解説】
^*1 ハイスループット実験装置
実験の回転速度をスループットと呼ぶ。ハイスループット実験装置とは高度な並列化や自動化によってスループットを劇的に改善する装置を指す。
^*2 メタンの酸化カップリング反応（OCM）
普遍的に存在するメタンはそのままでは化学的な有用性が低く、これを触媒によって別の有用化合物へ変換することが望ましい。メタンの酸化的カップリングとは、メタンと酸素分子の反応を通してエタンやエチレンを直接合成する高難度反応である。

令和3年1月27日

シリコン負極表面を高度に安定化する
ポリ（ボロシロキサン）型人工SEIの開発に成功

ポイント

• リチウムイオン２次電池のシリコン負極表面の劣化を抑制する人工SEIの開発に成功した。
• 350回の充放電サイクル時点で、ポリ（ボロシロキサン）をコーティングしたシリコン負極型セルは、PVDFコーティング系と比較して約２倍の放電容量を示した。
• 本人工SEIの好ましい特性の一つは自己修復能にあることがSEM測定から明らかになった。
• 充放電サイクル後に、本人工SEIを用いた電池系ではPVDF系と比較して大幅に低い内部抵抗が観測された。
• LiNMCを正極としたフルセルにおいても、ポリ（ボロシロキサン）コーティング系電池セルはPVDF系と比較して大幅に優れた性能を発現した。
• 低いLUMOによりポリ（ボロシロキサン）のコーティング層は初期サイクルで一部還元され、同時にリチウムイオンを含有した好ましいSEIを形成する。
• ヘキサンなどの低極性溶媒にも可溶であり、多様な系におけるコンポジット化、成膜に対応性を有している。

　本成果は、「ACS Applied Energy Materials」（米国化学会）オンライン版に１月19日に掲載された。

【今後の展開】

　自己修復能以外の他のメカニズムによりシリコンを安定化する他系との組み合わせにより相乗効果が大いに期待される。
　更なる改良に向けた分子レベルでの構造改変により高性能化を図る。
　電極―電解質界面抵抗を大幅に低減できる各種電極用高分子コーティング剤として、リチウムイオン２次電池のみならず広範な蓄電デバイスへの応用が見込まれる。

【用語解説】
^*1 リチウムイオン２次電池：
電解質中のリチウムイオンが電気伝導を担う２次電池。従来型のニッケル水素型２次電池と比較して高電圧、高密度であり、各種ポータブルデバイスや環境対応自動車に適用されている。
^*2 サイクリックボルタンメトリー（サイクリックボルタモグラム）：
電極電位を直線的に掃引し、系内における酸化・還元による応答電流を測定する手法である。電気化学分野における汎用的な測定手法である。また、測定により得られるプロファイルをサイクリックボルタモグラムと呼ぶ。
^*3 LUMO：
電子が占有していない分子軌道の中でエネルギー準位が最も低い軌道を最低空軌道（LUMO; Lowest Unoccupied Molecular Orbital）と呼ぶ。
^*4 電極―電解質界面抵抗：
エネルギーデバイスにおいては一般的に個々の電極の特性や個々の電解質の特性に加えて電極―電解質界面の電荷移動抵抗がデバイスのパフォーマンスにとって重要である。交流インピーダンス測定を行うことによって個々の材料自身の特性、電極―電解質界面の特性等を分離した成分としてそれぞれ観測し、解析することが可能である。

令和3年1月26日

新型コロナウイルスのアクセサリータンパク質ORF8大量合成に成功

　石川県立大学　森 正之准教授、今村 智弘特任講師、東村 泰希准教授が中心となり北陸先端科学技術大学院大学 生命機能工学領域の大木 進野教授と共同で、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)のアクセサリータンパク質ORF8について、独自に開発したタンパク質大量合成システムを用いて均一に大量合成することに成功しました。本研究成果は、「Plant Cell Reports」に公開されました。

　SARS-CoV-2が引き起こす新型コロナウイルス感染症（COVID-19）は、現在世界で猛威を振るっております。COVID-19の克服には、SARS-CoV-2のもつタンパク質の機能解明が必須であります。SARS-CoV-2のゲノム配列の解読により、SARS-CoV-2は、少なくとも１６種類の非構造タンパク質、４種類の構造タンパク質、少なくとも６または７種類のアクセサリータンパク質を感染細胞で合成することが明らかとなっております。この中で、アクセサリータンパク質の１つであるORF8タンパク質は、近縁ウイルスのORF8タンパク質と比べ相同性が低く、SARS-CoV-2において特徴的なタンパク質であります。ORF8は、免疫や炎症に関わるタンパク質に結合する可能性が報告されております。さらに、ORF8遺伝子領域が欠失したSARS-CoV-2株は、重症化しにくいことが報告されております。このことから、ORF8タンパク質は、COVID-19の重症化に関与していることが示唆されてきております。しかし、OFR8タンパク質の機能は解明されておりません。

　ORF8タンパク質の機能解明には、均一なORF8タンパク質を大量に合成することが必要です。しかし、ORF8タンパク質は分子内に3か所のジスルフィド 結合（S-S結合）を持ち、さらにS-S結合で2量体になる複雑なタンパク質です。そのため大腸菌での均一なORF8の合成は極めて困難であります。そこで、我々は、これまでにタバコ培養細胞（タバコBY-2細胞）を宿主として独自に構築した大量タンパク質合成システムを用いてORF8タンパク質の大量合成を試みました。この合成システムの特徴は、薬剤（エストラジオール）の添加によって、S-S 結合をもつ複雑な目的タンパク質を同調的に大量合成することができます（図１）。この生産システムを用いてORF8タンパク質の合成を試みたところ、培養液1 LあたりORF8タンパク質を約10 mg合成することに成功しました（図２）。合成したORF8タンパク質を核磁気共鳴（NMR）装置により解析を行ったところ、均一な構造を持つORF8タンパク質が生産されていることが明らかとなりました（図３）。

　本研究成果によって、タバコBY-2細胞を用いて、均一なORF8タンパク質の大量合成に成功しました。今後、本システムで合成したORF8を用いて、ORF8の機能が明らかになることが期待されます。さらに、ORF8をターゲットにした治療薬の開発が期待できます。

【論文情報】

図１：植物ウイルスを利用した薬剤誘導型ORF8タンパク質合成システムの概略図
①薬剤活性型転写因子（XVE）の発現。②薬剤（エストラジオール）添加によるXVEの活性化。③XVEによるトバモウイルス-ORF8融合遺伝子の発現。④リボザイムによるmRNA3'末端の切断。⑤サブゲノムRNAのmRNAの増幅。⑥ORF8タンパク質の翻訳。⑦ORF8タンパク質の細胞外への移行。ORF8タンパク質は、二量体を形成する。

図２：タバコ培養細胞を用いたORF8タンパク質の合成
(A) ORF8タンパク質を合成するタバコBY-2細胞 (B)薬剤誘導処理を行ったタバコBY-2細胞 (C) 培養液中に放出されたORF8タンパク質。矢じり：ORF8タンパク質、M：分子量マーカー

図３：ORF8タンパク質のNMRスペクトル
(A) ORF8タンパク質の¹H NMRスペクトル (B) ¹⁵NラベルをしたORF8タンパク質の二次元NMRスペクトル（¹H-¹⁵N HSQC）

令和3年1月7日

生体内の高分子混雑に着目した新規の細胞モデルの創成に成功

　名古屋大学大学院理学研究科の瀧口 金吾講師、同志社大学生命医科学部の作田 浩輝特任助教、藤田 ふみか大学院生、北陸先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科 生命機能工学領域の濵田 勉准教授、法政大学生命科学部の林 真人教務助手、三重大学大学院工学研究科の湊元 幹太教授、京都大学高等研究院医学物理・医工計測グローバル拠点の吉川 研一特任教授らの共同研究グループは、二種類の水溶性高分子のミクロ相分離条件下でDNAとリン脂質を共存させると、内部にDNAを取込み、リン脂質の膜で囲まれた細胞内小器官様の構造が自発的に生成することを発見しました。この発見が元になり、細胞が自律的に複雑な構造や高度な機能を生み出す機構の謎に迫る研究に発展することが期待されます。
　その成果をまとめた論文が、国際科学雑誌ChemBioChem誌のオンライン版に2020年7月15日付けで公開されましたが、この度、Very Important Paper の1つに選ばれ、研究内容を紹介するイラストがChemBioChem誌の2020年21巻23号に掲載されました。
　この研究は、平成24年度から始まった文部科学省科学研究費助成事業新学術領域『分子ロボティクス』プロジェクトおよび平成31年度から始まった日本学術振興会科学研究費助成事業『細胞結合ネットワークの構築による人工細胞モデルの組織化と集団動態発現』等の支援のもとでおこなわれたものです。

【ポイント】

• 異なる高分子 ^注１）の混雑によって高分子同士が相分離 ^注２）を起こしてミクロ液滴を形成している溶液にリン脂質を加えると、脂質が自発的にミクロ液滴の界面に局在化することで、細胞内小器官（オルガネラ）^注３）の形成に似た区画化を起こすことを発見した。
• この新知見を利用することで、リン脂質によって小胞化されたミクロ液滴の内部に、長鎖DNAを濃縮して封入させることに成功した。
• 本研究で見出されたミクロ液滴のリン脂質によって区画化される小胞化は、原始生命体（細胞の起源）のモデル実験系と成り得ると同時に、人工脂質膜小胞を調製するための有力な新手法として期待される。
• この研究成果をまとめた論文が、国際科学雑誌ChemBioChem誌に掲載され、さらに、Very Important Paper (VIP)に選ばれた。【論文を紹介するイラスト（下図）はChemBioChem誌の2020年21巻23号に掲載】

【研究背景と内容】

　近年、細胞内の複雑な構造が生み出される起源や、脂質膜によって区画化される多様な細胞内小器官および、顆粒などの膜によって隔てられていない領域 ^注３）などが形成・維持される機構について、相分離 ^注２）の視点から研究されています。
　本研究では、液－液相分離（LLPS）^注２）を示すことができる水溶性の高分子ポリマーであるポリエチレングリコール（PEG）およびデキストラン（DEX）^注１）の混合によってミクロ液滴を生成させた溶液にリン脂質を加えると、ミクロ液滴の界面に脂質が自発的に集まって膜を形成することを見出しました（図１）。この脂質に覆われたミクロ液滴が、外液の浸透圧を高張にすると、脂質二重膜でできた膜小胞と同様に破裂や穿孔、収縮をすることから（図２）、ミクロ液滴を覆う脂質が、生体膜の基本構造である脂質二重膜と同じ性質を示すことが分かりました。

図１：ミクロ液滴の界面へのリン脂質の蓄積。
リン脂質添加後のPEG / DEX混合溶液の顕微鏡画像（ミクロ液滴の生成を示す明視野像とリン脂質の局在を示す蛍光像）。蛍光像（白の破線部分）から得られた蛍光強度の空間プロファイル。

図２：高張な水溶液（NaCl溶液）の注入による脂質膜構造の形態変化。
外液の浸透圧が変化することによって、リン脂質に覆われたミクロ液滴の内部から外液に向かって大量の水分子が移動しようとする結果、脂質膜の破裂や穿孔や収縮が起きる。左から、破裂後のリン脂質の凝集塊、穿孔を起こした脂質膜の残骸、収縮した脂質膜。

　ところで、核酸であるDNAも生体内で重要な働きをしている天然の高分子です。我々共同研究グループの先行研究から、長鎖DNAがDEXを高濃度で含むミクロ液滴に遍在することが明らかにされていました。長鎖DNAを内部に濃縮して取込んだミクロ液滴を形成している相分離溶液系にリン脂質を加えると、やはり脂質が自発的にミクロ液滴を覆うことで、内部にDNAを含む細胞内小器官様の安定化された小胞の形成が認められました（図３）。
　このミクロ液滴からリン脂質膜で安定化された細胞内小器官様の小胞が自発的・自己組織的に創成されてくる過程は、原始の生命体の細胞の内部構造の起源を考える際の貴重な知見であり、多種類の高分子の混合によって細胞内小器官（オルガネラ）や膜によって隔てられていない構造が自発的に形成されてくる可能性を示した研究成果です。

図３：リン脂質の膜で区画化・小胞化されたミクロ液滴へのDNAの自発的なカプセル化。
長鎖DNAを含むPEG / DEX混合溶液にリン脂質を添加すると、自発的にDNAを取込んだ脂質の膜に覆われたミクロ液滴が生成される。

【成果の意義】

　本研究の発見は、多種類の高分子の混合によって生体高分子（ここでは長鎖DNA）を取込んだミクロ液滴が自発的に生じ、これに生体膜の重要な構成成分であるリン脂質を加えると、更にミクロ液滴の界面にリン脂質が集積して自己組織的に細胞内小器官様の小胞構造が形成されることを示した研究成果です。
　この発見の特筆すべきこととして、本研究で用いられたどの成分、高分子のPEGとDEX、生体高分子の長鎖DNA、そしてリン脂質も、酵素と基質との間に観られる鍵と錠との関係のような相互作用を互いに示さないことが挙げられます。このことは、生命現象の説明や理解に必ず分子間の特異的な相互作用の存在を想定して来たこれまでの生命科学に一石を投じるものであり、非常に重要です。
　細胞内では、細胞分裂の際、分離・分配された染色体が脂質の膜で覆われ核膜が再生することで２つの娘細胞の核が形成されます。また、オートファジーでは、変性したり役目を終えたりした生体因子や細胞内に侵入して来た細菌などの外敵の分解除去のため、あるいは細胞内物質のリサイクルのため、それらを取り込む様に脂質膜でできた"袋"を形成します。これらのことから、本研究で得られた知見は、非膜性の顆粒の様な細胞内領域と膜に覆われた細胞内小器官との関係に新たな視点を与えると共に、濃厚環境での生体高分子の在り様、細胞内に観察されるような重層的に区画された領域や細胞内小器官の様な特別な構造の起源の理解に迫る成果だと言えます。

【用語説明】

• 注１） 高分子（ポリマー）：
  ある化学物質が、様々な結合を介して連なっていくことで、より大きな分子になったもの。一本の鎖状のポリマーもあれば、枝分かれしながら繋がっているポリマーもあります。
  今回の研究で用いられたポリエチレングリコール（PEG）やデキストラン（DEX）は、その代表的なものです。
  DNAも、ヌクレオチドが連なってできた天然のポリマーです。生体内には、様々な糖鎖やアクチン線維や微小管の様なアクチンやチューブリンと呼ばれる蛋白質が繊維状に集まってできた細胞骨格などが存在していますが、これらも天然のポリマーと考えることができます。
• 注２） 相分離、液－液相分離 (Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS)：
  LLPSは、複数の水溶性高分子を混合し混雑化すると（図４ (a)）、ある高分子が他の高分子よりも高濃度で存在する領域が水溶液中に現れる現象です。このように異なる領域に分かれていく現象を相分離と呼びます。そのようにしてできてくる領域ですが、混合の仕方によって生きた細胞や細胞内小器官と同等のサイズを持つミクロ液滴になります。
  今回の研究では、PEGが濃く存在する溶液中に、DEXが濃く存在するミクロ液滴が生じる条件下で実験が行われました（図４ (b)）。

図４：PEGとDEXの混合（左）によって生じるLLPS（上）。Bars = 100 μm。本共同研究グループの先行研究論文 ChemBioChem 2018, 19(13), 1370-1374 (Figure S1) より転載。

• 注３） 細胞内小器官（オルガネラ）：
  細胞内に存在する核やミトコンドリア、ゴルジ体などの総称。
  これまで細胞内小器官は、膜によって外界から隔てられて、その構造や機能が維持されていると考えられてきました。しかし近年、膜によって外部から隔てられていない領域・顆粒（例として核小体やストレス顆粒など）が、非膜性の細胞内小器官として重要な働きを担っていることが分かってきて、それらの形成維持機構が、細胞内の複雑で階層的な構造の組織化に関連して議論される様になっていました。

【論文情報】

【研究費】

・科研費　基盤研究（A）（15H02121）
・科研費　基盤研究（C）（19K06540）
・科研費　基盤研究（B）（20H01877）
・特別研究員奨励費（18J12947）
・文部科学省新学術領域研究
「アメーバ型分子ロボット実現のための要素技術開発とその統合」（24104004）
・文部科学省新学術領域研究
「ゆらぎと構造の協奏：非平衡系における普遍法則の確立」（25103012）
・文部科学省新学術領域研究
「宇宙からひも解く新たな生命制御機構の統合的理解」（18H04976）

令和2年12月9日

　東京大学大学院農学生命科学研究科大西康夫教授、北陸先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科金子達雄教授、神戸大学大学院工学研究科荻野千秋教授、筑波大学生命環境系高谷直樹教授らの研究チームは、史上最高耐熱のプラスチックを植物原料から開発し、10月12日に、東京大学においてオンラインによる記者会見を行いました。
　記者会見には本学環境・エネルギー領域の金子 達雄教授が出席しました。

　また、本成果は、「Advanced Sustainable Systems」オンライン版にて10月14日に掲載されました。

＜記者会見出席者＞

本学発表者：金子 達雄（北陸先端科学技術大学院大学 先端科学技術研究科 環境・エネルギー領域　教授）
研究チーム代表者：大西 康夫（東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻

　　　　　　　　　東京大学微生物科学イノベーション連携研究機構　教授）

＜ポイント＞

• 紙パルプを原料にして超高耐熱性プラスチックであるポリベンズイミダゾールを生産する新規プロセスを開発しました。
• 新しいポリマーデザインにより、プラスチック史上、最高の耐熱性を達成しました。
• 開発した超高耐熱性バイオプラスチックは、強度や軽量性にも優れており、さまざまな用途で利用が見込めるため、脱石油化・低炭素化社会の構築に貢献できると期待されます。

＜研究の概要＞
　循環型社会の構築にはバイオマス由来のプラスチックの利用が望まれますが、従来のバイオマス由来プラスチックは耐熱性が低いため、その用途が限られていました。この度、本学環境・エネルギー領域の金子達雄教授が所属する研究チーム（代表：大西康夫教授（東京大学大学院農学生命科学研究科））は、超高耐熱性プラスチックをバイオマスから作ることに成功しました（図１）。当該チームは高耐熱性のポリベンズイミダゾール（PBI）（注１）に着目し、その原料となる芳香族化合物を効率よく生産する遺伝子組換え微生物を創成しました。また、代表的な非可食バイオマスである紙パルプを効率的に酵素糖化し、高濃度のグルコースを含む糖化液を生産するシステムを開発しました。一方、化成品を用いた検討により、PBIフィルムの作製法を開発するとともに、PBI原料とアラミド繊維（注２）原料を共重合することで耐熱性が大きく向上することを見出し、史上最高耐熱のプラスチックフィルムの作製に成功しました。また、紙パルプ糖化液を使って発酵生産した芳香族化合物から同等の性質を有するPBIフィルムを作製できることを示しました（10％重量減少温度743℃、表１）。開発した超高耐熱性バイオPBIは、強度や軽量性にも優れており、さまざまな用途で利用が見込めるため、脱石油化・低炭素化社会への貢献が期待されます。

＜研究の内容＞
　近年、国連が採択したSDGs（Sustainable Development Goals：持続可能な開発目標）がますます注目を集めています。脱石油化、低炭素化のためには、バイオマス由来のプラスチックの普及が重要ですが、これまでに開発されてきたバイオマス由来のプラスチック（ポリアミド11、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリ乳酸など）はいずれも脂肪族ポリマーであり、耐熱性が低いため、その用途が限られていました。芳香族系ポリマーは耐熱性が高いことで知られていますが、その原料はすべて石油由来の芳香族化合物です。天然に存在する芳香族ポリマーであるリグニン（注３）の利用も検討されていますが、リグニンは複雑な分子構造をしているため、リグニンを使って耐熱性の高いプラスチックを作るには、多くの困難があります。そのため、芳香族系ポリマーの原料となる芳香族化合物を再生可能資源から入手するというアプローチが重要であり、これには微生物を用いた発酵生産が有力です。しかしながら、実際に発酵生産させた芳香族化合物を用いて芳香族ポリマーを合成したのは、今回の研究チームのメンバーが以前に行った数例が知られているだけです（文献1、2）。また、これらの研究では、試薬として購入したグルコースを炭素源として微生物を増殖させていましたが、微生物による有用物質生産では、食料と競合する材料ではなく、非可食バイオマス（稲わら、とうもろこしの芯、サトウキビの絞りかす、紙パルプなど）の利用が求められています。
　このような背景のもと、研究チームは、科学技術振興機構 (JST) 戦略的創造研究推進事業(CREST)「二酸化炭素資源化を目指した植物の物質生産力強化と生産物活用のための基盤技術の創出」において、「高性能イミダゾール系バイオプラスチックの一貫生産プロセスの開発（平成25年度から平成30年度）」に取り組み、超高耐熱性プラスチックをバイオマスから作ることに成功しました（図１）。
　当該研究チームでは、代表的な非可食バイオマスである紙パルプを効率的に酵素糖化し高濃度のグルコースを含む糖化液（最高で90 g/L）を生産するシステムを開発しました（神戸大）。また、高耐熱性のポリベンズイミダゾール（PBI）に着目し、その原料となる芳香族化合物（3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸：AHBA）を生産する遺伝子組換えコリネ菌を用いて、紙パルプ糖化液からAHBAを発酵生産し（3.3 g/L）、高純度に精製しました（神戸大、東大）。一方、共重合用の化合物として着目した4-アミノ安息香酸（ABA：アラミド繊維原料）を生産する遺伝子組換え大腸菌を構築し、同じく紙パルプ糖化液からABAを発酵生産し（1.6 g/L）、高純度に精製しました（筑波大）。一方、化成品を用いた検討により、まず、PBIの直接の原料となる3,4-ジアミノ安息香酸（DABA）をAHBAから簡便に合成する方法、DABAからPBIフィルムを作製する方法を開発しました（北陸先端大）。また、DABAとABAを共重合することで耐熱性が大きく向上することを見出し、これまでに存在するプラスチックの中で最高耐熱を達成しました（DABA:ABA=85:15のコポリマーの10％重量減少温度は740℃超、表１）（北陸先端大）。最終的に、紙パルプ糖化液を使って発酵生産した芳香族化合物から同等の性質を有するPBIフィルムを作製できることを示し、紙パルプから超高耐熱性PBIフィルムの一貫生産プロセスのプロトタイプを構築することに成功しました。
　開発した超高耐熱性バイオPBIは、強度や軽量性にも優れており、さまざまな用途で利用が見込めます。まず、耐熱性が非常に高く、さまざまな軽量金属（アルミニウム、マグネシウム、亜鉛、錫など）の融点で分解が起こらないため、これらの軽量金属と溶融複合化することができ、軽量化社会で重要となる自動車ボディ、建築部材などの社会インフラ、軽量・高耐熱性が求められる駆動部位周辺具材（電線エナメル、高耐熱絶縁紙、マニホールド、オイルパン）への応用も考えられます。超難燃性の求められる航空・宇宙機器の部品などへの活用も想定されます。これらの輸送機器はグラム単位での軽量化が要求されており、バイオPBIによりエネルギー削減、脱石油化・低炭素化社会への貢献が期待されます。また、PBIをLiイオン化し、Liイオン電池の固体電解質として利用できることを既に明らかにしており、より高耐熱の固体電解質開発も可能と考えられ（文献3）、次世代電気自動車開発に貢献できると考えています。
　なお、本研究チームメンバーは内閣府戦略的イノベーション創造プログラム（SIP）「スマートバイオ産業・農業基盤技術」に採択され、現在も引き続きバイオPBIの社会実装に向けた研究開発に取り組んでいます。

1. Tomoya Fujita, Hieu Duc Nguyen, Takashi Ito, Shengmin Zhou, Lisa Osada, Seiji Tateyama, Tatsuo Kaneko, Naoki Takaya. Microbial monomers custom-synthesized to build true bio-derived aromatic polymers. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97(20):8887-8894. (2013) doi: 10.1007/s00253-013-5078-4.
2. Yukie Kawasaki, Nag Aniruddha, Hajime Minakawa, Shunsuke Masuo, Tatsuo Kaneko, Naoki Takaya. Novel polycondensed biopolyamide generated from biomass-derived 4-aminohydrocinnamic acid. Appl. Microbiol. Biotechnol. 102(2):631-639. (2018) doi: 10.1007/s00253-017-8617-6.
3. Aniruddha Nag, Mohammad Asif Ali, Ankit Singh, Raman Vedarajan, Noriyoshi Matsumi, Tatsuo Kaneko. N-Boronated Polybenzimidazole for Composite Electrolyte Design of Highly Ion Conductive Pseudo Solid State Ion Gel Electrolytes with High Li Transference Number. J. Mater. Chem. A. 7(9): 4459-4468. (2019) doi: 10.1039/c8ta10476j.

＜論文情報＞

＜用語解説＞
（注１）ポリベンズイミダゾール
　高耐熱性ポリマーであるポリベンズアゾール類の一種であり、繰り返し単位中に「ベンズイミダゾール」を含んでいる高分子の総称。
（注２）アラミド繊維
　芳香族ポリアミド系樹脂の総称。耐熱性や強度に優れた合成繊維であり、様々な用途で利用されている。
（注３）リグニン
　セルロース、ヘミセルロースとともに木材を構成する主要成分であり、芳香環を有する不定形な高分子化合物。

表１　新規開発バイオPBIおよびアラミド含有バイオPBIの熱分解温度の比較表

＊Bio-Ami-PBIは、史上最高の熱分解温度で力学物性も十分に高い（ナイロンと同等）

図１　 紙パルプから超高耐熱性プラスチックフィルムの一貫生産プロセス

令和2年10月14日

世界初 キヌアからブラッダー細胞形成遺伝子を発見

　石川県立大学 森 正之准教授、今村 智弘特任講師、古賀 博則客員教授、高木 宏樹准教授、北陸先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科、生命機能工学領域の大木 進野教授らは、(公財)岩手生物工学研究センターなどの機関と共同で、塩生植物キヌア（Chenopodium quinoa）からブラッター細胞の形成に関わる遺伝子を発見しました。 本研究成果は、「Communications Biology」で公開されました。

＜ポイント＞

• キヌアからブラッダー細胞形成に関わる新規WD40タンパク質をコードするREBC遺伝子を発見
• REBC遺伝子は、ブラッダー細胞形成のみならず葉緑体形成にも関与していることを発見
• ブラッダー細胞の茎頂保護機能を発見

＜発表論文＞

＜研究の背景＞

　国連大学の報告によると、世界の灌漑地の約1/5が塩害にさらされています。その被害は、年間およそ273億USドルの経済損失を引き起していることが報告されており、今後さらに広がることが予想されています。一方、世界の人口は、2050年までに97億人に達することが予想されております。そのため、この人口の爆発的な増加に耐えうる食糧生産は、早急に解決すべき大きな課題となっております。しかし、主要穀物である小麦やイネなどは、塩に弱いで植物であり、これらの主要穀物に対する塩害は、食糧生産において大きな問題となります。キヌアは、非常に高い耐乾燥性と耐塩性を併せ持ち、他の植物では生育困難な厳しい環境で生育できる塩生擬似穀物です。さらに、キヌアの種子は、必須アミノ酸・ミネラル・植物繊維を豊富に含み高い栄養価を持つことから、国際連合食糧農業機関（FAO）では、世界の食糧問題解決の切り札になり得るスーパーフードとして注目されています。
　キヌアを含めたアカザ属植物は、植物体の表面に球状の表皮細胞（ブラッダー細胞）を形成します（図１）。ブラッダー細胞は、通常細胞の1000倍以上の大きさがあり、細胞内に高濃度の塩を蓄積することが知られています。このブラッダー細胞の性質は、キヌアの高い塩耐性の一因と考えられています。独自の形態と機能を持つブラッダー細胞ですが、その形成メカニズムは全く分かっていませんでした。
　本研究では、塩生植物のキヌアに形成されるブラッダー細胞の形成機構を明らかにするために、ブラッダー細胞の形成に関わる遺伝子の単離を試みました。その結果、EMS処理の変異原処理により、ブラッダー細胞が著しく減少したrebc変異体を獲得し、次世代シークエンサーを用いた解析により、ブラッダー細胞形成に関わるrebc変異体の原因遺伝子(REBC)の単離に成功しました。その単離したREBC遺伝子は、ブラッダー細胞を形成しない植物には存在しないことが明らかとなりました。このことから、ブラッダー細胞の形成機構は、同じ植物の表皮細胞であるトライコームの形成機構とは異なることが示唆されました。さらに、rebc変異体はブラッダー細胞の形成のみならず葉緑体の形成にも影響を及ぼしていることが明らかとなりました。また、rebc変異体を用いた環境ストレス実験により、ブラッダー細胞は、塩を蓄積するだけでなく、その細胞を密集させることにより茎頂などの組織を環境ストレスから保護していることが明らかとなりました。

＜研究の内容＞
1.ブラッダー細胞が減少した変異体の作出
　ブラッター細胞の形成に関わる遺伝子を単離するために、約8000粒のキヌア種子ついて、EMSを用いた変異原処理を実施しました。その結果、大部分のブラッダー細胞が欠失した変異体を得ることができました（図２）。この変異体を reduced epidermal bladder cells (REBC)変異体と命名しました。rebc変異体の分離比を確認しましたところ、野生型とrebc変異の割合が３：１に分離しました。興味深いことに、キヌアは異質４倍体の植物にもかかわらず、rebcの形質は、一遺伝子支配の劣勢形質であることがわかりました。

2.環境ストレス試験
　キヌアは、ブラッダー細胞に塩を高濃度に蓄積することにより、高塩環境においても正常に生育できることが知られています。そこで、大部分のブラッダーが欠失したrebc変異体について、塩ストレス実験を実施しました。その結果、rebc変異体は、野生型に比べて高濃度の塩条件において生育が阻害されていることがわかりました。さらに、別の環境ストレスとして、茎頂に風を当て続けたところ、野生型では問題なく生育したのですが、rebc変異体では風によって茎頂にダメージを受けていることが明らかとなりました（図３）。これらの実験からブラッダー細胞は、塩を蓄積する機能のほかに、茎頂などの特定の組織に密集して存在することにより、風などの環境ストレスから組織を保護していることが新たに明らかとなりました。

3.rebc変異体の原因遺伝子の特定
　rebc変異体の原因遺伝子を明らかにするために、次世代シークエンサーを用いたin silico subtraction 法を利用して変異箇所の特定を試みました。その結果、rebc変異体は、新規なWD40ドメインタンパク質遺伝子の変異が原因であることを明らかにし、その遺伝子をREDUCED EPIDERMAL BLADDER CELLS (REBC)遺伝子と名付けました（図４）。他植物の表皮細胞であるトライコームでは、その形成に関与する遺伝子が同定されており、その中でWD40ドメインタンパク質としてTTG1遺伝子が重要な役割をしています。REBCとTTG1を比較したところ、これらのタンパク質は、別の機能を持つタンパク質であることが示唆されました（図５）。またトライコームを形成する植物体には、REBC遺伝子のオルソログが存在しませんでした。これらの結果より、ブラッダー細胞の形成は、トライコームとは異なる機構の存在が示唆されました。

4.rebc変異体における葉緑体形成
　rebc変異体について、網羅的な発現解析を実施したところ、発現が変動した遺伝子の多くが葉緑体局在タンパク質をコードする遺伝子でありました。さらに、クロロフィル含量を測定したところ、rebc変異体のクロロフィル含量が有意に低下していることが明らかとなりました。そこで、rebc変異体の葉緑体の形態について、電子顕微鏡を用いて観察しました。その結果、rebc変異体の葉緑体は、内部構造の約1/3が欠失していることが明らかとなりました（図６）。さらに、ブラッダー細胞の葉緑体を観察した結果、rebc変異体のブラッダー細胞の中の葉緑体は、野生型に比べクロロフィルの自家蛍光の強度が低下し、さらにブラッダー細胞あたりの葉緑体数が減少していることが明らかとなりました。以上の結果より、rebc変異体は、ブラッダー細胞の形成のみならず、葉緑体の形成にも影響を及ぼしていることが明らかになりました。

＜今後の展望＞
　本研究成果によって、キヌアのブラッダー細胞形成に関する分子メカニズムの一端を明らかにすることができました。今後、ブラッダー細胞の形成に関する分子メカニズムの全容が明らかになることが期待できます。さらに、ブラッダー細胞形成の知見を利用することによって、キヌアの塩耐性機構を組み入れた新たなコンセプトの環境ストレス耐性作物を作出することが期待できます。

図１　キヌアのブラッダー細胞　（a）キヌア植物体、（b）キヌアの葉（裏側）、（c）キヌアの葉(拡大)、
(d-f)　キヌアブラッダー細胞　BC:ブラッダー細胞、SC: 柄細胞

図２　rebc変異体について　(a-c)キヌア芽生え　（d-f）キヌア芽生え（茎頂付近）
（a, d）野生型、（b, e）rebc1変異体、（c, f）rebc2変異体

図３　風ストレス処理による影響　（a）野生型、（b）rebc1変異体、（c）rebc2変異体
・rebc変異体は風ストレスによって、茎頂が枯死している。

図４　REBC遺伝子の単離 (a) REBC遺伝子の概略図　赤矢印はrebc変異体の変異箇所
（b）rebc1×rebc2交配後代(F1)の解析
・rebc1×rebc2交配個体も、rebc変異の形質を示したことから、REBCが原因遺伝子であることが明らかとなった。

図５　(a) REBCとTTG1との比較（系統樹解析）、(b) アラビドプシスttg1変異体を用いた相補実験
上段：ベクターコントロール、中段：REBC過剰発現体、下段：AtTTG1過剰発現体
・REBCタンパク質は、TTG1タンパク質とは別のグループに属し、TTG1の機能を相補することができない。

図６　rebc変異体の葉緑体について　(a-c) 走査型電子顕微鏡像　（b-f）透過型電子顕微鏡像
（a, d）野生型、（b, e）rebc1変異体、（c, f）rebc2変異体
・rebc変異体では、葉緑体の膜構造1/3が欠失している。

＜用語説明＞

• キヌア
  　ヒユ科アカザ亜科アカザ属の植物。南米アンデス原産の穀物で必須アミノ酸・ミネラル・植物繊維を豊富に含み高い栄養価を持ち、さらに、環境適応能力が高く、非常に高い耐乾燥性と耐塩性を合わせ持ち、国際連合食糧農業機関（FAO）は、世界の食糧問題解決の切り札になり得る作物として注目している。近年、我々のグループとその他のグループによってキヌアゲノムが解読され、キヌアが持つ環境ストレス耐性および高栄養価についての遺伝子研究が進められている。
• 擬似穀物
  　米や麦などのイネ科（禾穀類）や、大豆や小豆などのマメ科（菽穀類）ではないが、見た目がイネ科の穀物に類似した食べられる種子を形成する植物（ソバ、キヌア、アマランサスなど）を指す。
• in silico subtraction法
  　次世代シークエンサーのシークエンスデータを用いて、サンプル間の塩基配列の違い（多型、変異箇所）を特定する方法。異質倍数体の植物（キヌアは異質４倍体）でも検出が可能。本研究では、親から分離した後代について、野生型形質を示す個体群と、rebc変異形質を示す個体群を、それぞれまとめてゲノムを抽出し、次世代シークエンサーによって、それぞれの形質を示す個体群のシークエンスリードを獲得。その後、二形質間のシークエンスリードを比較することにより、形質を支配する遺伝子を特定した。

令和2年9月17日

国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学

＜参　考＞
1　ムーンショット型研究開発制度
　本制度の詳細については、以下を参照
　https://www8.cao.go.jp/cstp/moonshot/index.html

2　ムーンショット目標
　2020年1月CSTIにおいてムーンショット目標1～6が決定。2020年7月には健康・医療戦略推進本部においてムーンショット目標7が決定

　目標1：2050年までに、人が身体、脳、空間、時間の制約から解放された社会を実現
　目標2：2050年までに、超早期に疾患の予測・予防をすることができる社会を実現
　目標3：2050年までに、AIとロボットの共進化により、自ら学習・行動し人と共生するロボットを実現
　目標4：2050年までに、地球環境再生に向けた持続可能な資源循環を実現
　目標5：2050年までに、未利用の生物機能等のフル活用により、地球規模でムリ・ムダのない持続的な
　　　　 食料供給産業を創出
　目標6：2050年までに、経済・産業・安全保障を飛躍的に発展させる誤り耐性型汎用量子コンピュータを実現
　目標7：2040年までに、主要な疾患を予防・克服し100歳まで健康不安なく人生を楽しむための
　　　　 サステイナブルな医療・介護システムを実現

3 　NEDOムーンショット型研究開発事業の採択結果
　https://www.nedo.go.jp/news/press/AA5_101346.html

令和2年9月7日